LITOS: una herramienta de iluminación LED versátil para la estimulación optogenética

Dec 22, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13139 (2022) Citar este artículo

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La optogenética se ha convertido en una herramienta clave para manipular procesos biológicos con alta resolución espacio-temporal. Recientemente, se han desarrollado una serie de dispositivos de iluminación de múltiples pozos comerciales y de código abierto para proporcionar rendimiento en experimentos de optogenética. Sin embargo, los dispositivos comerciales disponibles siguen siendo costosos y carecen de flexibilidad, mientras que las soluciones de código abierto requieren conocimientos de programación y/o incluyen procesos de ensamblaje complejos. Presentamos una herramienta de iluminación LED para estimulación optogenética (LITOS) basada en una placa de circuito impreso ensamblada que controla una matriz LED de 32 × 64 disponible comercialmente como fuente de iluminación. LITOS se puede ensamblar rápidamente sin soldadura e incluye una interfaz fácil de usar, accesible a través de un sitio web alojado en el propio dispositivo. Los patrones de estimulación de luz complejos se pueden programar fácilmente sin experiencia en codificación. LITOS se puede utilizar con diferentes formatos de placas de pocillos múltiples, placas de Petri y matraces. Validamos LITOS midiendo la actividad de la vía de señalización MAPK/ERK en respuesta a diferentes regímenes dinámicos de estimulación de luz utilizando actuadores optogenéticos FGFR1 y Raf. LITOS puede estimular uniformemente todas las células en un pozo y permite esquemas de estimulación temporal flexibles. La asequibilidad y facilidad de uso de LITOS tiene como objetivo democratizar la optogenética en cualquier laboratorio.

Si bien la optogenética se utilizó por primera vez en neurobiología1, ahora se usa ampliamente para controlar una amplia variedad de procesos biológicos celulares con alta resolución espacio-temporal2. Esto ha sido posible gracias al descubrimiento de una serie de dominios de proteínas sensibles a la luz que se diseñaron para construir actuadores para controlar casi cualquier proceso biológico celular2. La precisión de la optogenética para perturbar los sistemas celulares puede conducir a una comprensión más profunda de su regulación dinámica3. Sin embargo, los experimentos optogenéticos también requieren hardware de estimulación óptica apropiado.

Una configuración experimental optogenética clásica utiliza microscopios de luz automatizados para estimular las células que expresan actuadores optogenéticos y registrar cualquier salida celular deseada. Cuando se combina con biosensores espectralmente compatibles en un microscopio de fluorescencia, esta configuración puede controlar la entrada celular usando el actuador optogenético y registrar la dinámica de salida usando el biosensor4. Esto ha demostrado ser un enfoque muy poderoso para estudiar la dinámica de señalización5,6,7. Desafortunadamente, el campo de visión del sistema de lentes del microscopio limita el número de células que reciben la estimulación lumínica. Por lo tanto, los microscopios no pueden estimular suficientes células para medir los resultados celulares utilizando métodos bioquímicos. Además, el número de patrones de estimulación de entrada diferentes que pueden inducirse en paralelo está restringido. Finalmente, cualquier control optogenético a largo plazo de las células en escalas de tiempo de varios días podría ser poco práctico o demasiado costoso, especialmente en las instalaciones de microscopía.

El uso de una fuente de iluminación dedicada para separar la estimulación del proceso de formación de imágenes evita algunas de estas limitaciones. Las tiras de LED montadas en una incubadora se pueden utilizar para estimular un activador optogenético en un gran número de células, lo que abre la posibilidad de medir los resultados celulares mediante métodos bioquímicos como western blot, proteómica o transcriptómica8.

Las configuraciones más avanzadas combinan microcontroladores y fuentes de luz para iluminar específicamente pozos individuales desde placas de múltiples pozos. Esto permite estimular múltiples pozos con diferentes patrones de entradas de luz en paralelo, lo que da como resultado un mayor rendimiento experimental. Se han desarrollado varias soluciones de hardware que aprovechan los LED como fuentes de iluminación9,10,11,12. Esos dispositivos de código abierto son bastante baratos pero requieren conocimientos de programación y pueden depender de la experiencia de fabricación que no está disponible en la mayoría de los laboratorios. Recientemente, algunos productos comerciales (p. ej., LUMOS de AXION Biosystems) han ingresado al mercado, pero su costo sigue siendo alto. Todavía falta en la comunidad optogenética un dispositivo económico, fácil de ensamblar y fácil de usar que brinde flexibilidad experimental.

Aquí presentamos una nueva herramienta de iluminación LED para estimulación optogenética (LITOS) para democratizar la optogenética en cualquier laboratorio de biología celular. LITOS permite la estimulación lumínica dinámica de alto rendimiento de grandes poblaciones de células en diferentes formatos de placas de pocillos múltiples, placas de Petri o matraces de cultivo celular. Su facilidad de uso permite a los usuarios con pocos conocimientos técnicos y sin habilidades de codificación utilizar fácilmente el dispositivo y configurar patrones de iluminación complejos. Además, LITOS se puede ensamblar fácilmente con herramientas mínimas. Brindamos una descripción detallada del ensamblaje de LITOS y documentamos una solución GUI fácil de usar para configurar patrones de iluminación complejos. Validamos LITOS utilizando líneas celulares de mamíferos que expresan actuadores optogenéticos basados ​​en FGFR1 y Raf, y evaluamos la vía de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK)/quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) como salida de señalización, utilizando enfoques bioquímicos y de imágenes.

Para minimizar la necesidad de procedimientos de fabricación complejos, basamos LITOS completamente en componentes disponibles comercialmente (Figs. 1, 2a). LITOS se basa en una placa de circuito impreso (PCB) personalizada, que se puede pedir preensamblada a un fabricante de PCB. El PCB actúa como una unidad de control para una matriz de LED RGB disponible en el mercado. La PCB contiene un microcontrolador ESP32, que proporciona suficiente potencia computacional para controlar la matriz de LED y un nodo de red inalámbrica (Fig. 2b). La matriz de LED RGB consta de una matriz de 32 × 64 LED con un paso de 3 mm que permite la iluminación con cualquier combinación de luz roja, verde y azul. Puede iluminar células cultivadas en placas de 6, 12, 24, 48 o 96 pocillos múltiples, así como placas de Petri y frascos de cultivo celular (Fig. 2c). Elegimos este formato de matriz de LED de paso de 3 mm porque se alinea perfectamente con el diseño típico de placa de 96 pocillos (9 mm), lo que da como resultado una matriz de LED de 2 × 2 centrada en cada pocillo. Además, la matriz LED RGB permite al usuario modular a voluntad la intensidad de los tres colores. Cada uno de los LED individuales produce un cono de luz que ilumina un área que aumenta con la distancia de la muestra al LED. Por lo tanto, al aumentar la distancia entre la muestra y el LED, el campo de iluminación se vuelve progresivamente más homogéneo (Figura complementaria S1a, b). Mostramos que cuando la muestra se coloca a 2 mm de los LED, como es el caso de las placas de 96 pocillos múltiples que utilizamos en este estudio, se somete a una iluminación homogénea, con una variación de intensidad de luz máxima del 25 % en el borde del pozo. El aumento de esta distancia mejora aún más la homogeneidad de la iluminación, sin embargo, a costa de iluminar parcialmente los pozos vecinos en una placa de 96 pozos múltiples (Fig. S1a, b complementaria). Si bien esta sigue siendo una opción, LITOS no requiere un difusor de luz para mejorar la uniformidad de la iluminación en un pozo, como se usa en dispositivos similares9. Además, la matriz de LED de LITOS permite controlar LED individuales dentro de un pozo de una placa de 96 pozos múltiples para construir patrones de iluminación de luz no homogéneos que podrían ser ventajosos en algunos experimentos (Fig. S1c complementaria). Al modular la intensidad de los LED individuales, LITOS puede generar gradientes de luz en escalas de cm (Fig. S1d complementaria).

Esquemas de los componentes de LITOS. LITOS se compone de dos partes: una placa de circuito impreso (PCB) que actúa como unidad de control y una matriz de LED RGB de 32 × 64 disponible comercialmente. LITOS se puede controlar con una computadora o teléfono inteligente a través de una conexión WLAN. El PCB controla la matriz LED RGB de 32 × 64 para iluminar las células optogenéticas. La matriz LED densamente inclinada permite la iluminación de varios platos de cultivo celular y placas de pocillos. Con una pantalla y cuatro botones, LITOS se puede controlar directamente y puede mostrar mensajes sobre la ejecución de un experimento o sobre acciones que requieren la intervención del usuario.

LITOS puede generar patrones de estimulación de luz flexibles. (a) Una vez ensamblado, LITOS se compone de la placa de circuito impreso y la matriz de LED de 32 × 64. Aquí, LITOS se usa para generar una matriz de 8 × 12 de 4 LED por pocillo para estimular cada pocillo de una placa de 96 pocillos. (b) El PCB proporciona todo lo necesario para operar la matriz: el microcontrolador con módulo WLAN, las conexiones a la matriz LED, una pantalla y cuatro botones para acciones definidas por el usuario (p. ej., marcar el contorno de una placa, iniciar y terminar el experimento) . (c) Ejemplos de aplicaciones de LITOS con diferentes formatos de platos o platos. Panel izquierdo: estimulación simultánea de dos placas de 96 pozos, usando una máscara de plexiglás opcional para la alineación de la placa. Arriba a la derecha: dos placas de petri de 100 mm. Abajo a la izquierda: patrón de iluminación alterna para una sola placa de 96 pocillos. Abajo a la derecha: patrón de estimulación para una placa de 6 pocillos.

El módulo PCB y la matriz LED RGB están conectados con un cable plano y un cable de alimentación. Este sencillo procedimiento de montaje no requiere soldadura. Los esquemas de LITOS, así como para un caso impreso en 3D opcional (Fig. S2 complementaria), se encuentran en nuestra página de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Para facilitar la alineación de las placas en entornos oscuros, implementamos 3 soluciones: (i) usar LITOS para mostrar un contorno de referencia de la placa de pocillo deseada en la matriz LED, que se puede activar directamente mediante un botón en la PCB (Fig. S3a complementaria ); (ii) alinear la placa con la esquina superior izquierda de la matriz de LED (Fig. S3b complementaria) y (iii) usar una máscara que coloque la placa en la matriz de LED (esta última se puede producir mediante impresión 3D o fresado CNC) ( Figura complementaria S3c). El uso de una máscara de este tipo también permite colocar y estimular dos placas de pocillos múltiples en un dispositivo LITOS simultáneamente.

El costo total de LITOS, que comprende una PCB personalizada ensamblada por un fabricante de PCB y una matriz de LED lista para usar, representa aproximadamente USD 200.00. Este bajo precio del dispositivo permite escalar fácilmente los experimentos al pedir más unidades. Al pedir varios dispositivos, el precio unitario puede reducirse aún más.

Al igual que con el hardware, el software de LITOS fue diseñado para ser fácil de usar. El software presente en la unidad de control utiliza esquemas de iluminación definidos por el usuario, que luego se procesan para controlar la matriz LED (Fig. 3a–c).

Flujo de trabajo general del usuario de LITOS. ( a ) Esquema del flujo de trabajo experimental para generar patrones de iluminación específicos. Se puede cargar un archivo csv con el patrón deseado a través de un navegador web en la "Interfaz de configuración" alojada por la unidad de control. Luego, la unidad de control opera la matriz de LED de acuerdo con el patrón de iluminación cargado. (b) Ejemplo de archivo csv utilizado para un patrón de iluminación específico. Aquí, los pozos A01 y B01 están programados para iluminarse cada 5 min con un pulso de luz azul de 3 s; Los pocillos C01 y D01 se programan con el mismo patrón pero con un retraso de 30 min. En ambos casos el experimento tiene una duración total de 1 h. (c) La interfaz de usuario alojada por LITOS se utiliza para transferir los patrones de iluminación, que posteriormente se pueden cargar para experimentos de optogenética.

No se necesitan conocimientos de programación para configurar los patrones de iluminación deseados. Para definir qué LED deben encenderse, a qué hora específica, durante qué duración específica y en qué color específico, el usuario crea un archivo de valores separados por comas (csv). Esto se puede hacer usando aplicaciones de hojas de cálculo, como Google Sheets, Microsoft Excel o LibreOffice Calc. En el archivo csv, cada línea describe un comando de iluminación (Fig. 3b). Cada columna indica diferentes parámetros del programa de estimulación: LEDs a activar, hora de inicio de la iluminación, duración de la iluminación, color e intensidad de los LEDs activos. Para liberar parte de los recursos limitados del microcontrolador para otros procesos de software, limitamos la duración mínima del pulso a 1 s. Otras columnas permiten la generación de bucles para repetir un patrón de estimulación varias veces (p. ej., iluminadas cada 10 min durante 3 h). Para que el usuario no siempre tenga que definir LED individuales, diseñamos palabras clave para iluminar regiones predefinidas: (i) Pozo (p. ej., "A02"/ "A2" para Pozo A02); (ii) Columna y fila (por ejemplo, "D" para toda la fila D); (iii) placa completa de múltiples pocillos (Placa); (iv) matriz entera (Total); (v) círculo y rectángulos (Rec_start_end). El software de LITOS traduce estas palabras clave en las posiciones LED correspondientes de la matriz. Para mayor flexibilidad, también es posible controlar LED individuales, lo que permite, por ejemplo, la generación de gradientes de intensidad y/o color, o la visualización de texto.

Además, dentro de dichos archivos csv, se pueden programar mensajes personalizados con cuentas regresivas para que se muestren en la unidad de control. Esto puede ayudar al usuario con cualquier tarea adicional durante el experimento optogenético, como pipetear un reactivo a un pozo específico, por ejemplo. Como estas tareas pueden ser sensibles al tiempo, un pequeño zumbador piezoeléctrico apoya al usuario con señales auditivas adicionales además de las visuales.

Luego, el archivo csv del patrón de iluminación se transfiere a la unidad de control a través de su módulo Wi-Fi. Una interfaz de configuración basada en java-script (Fig. 3c) está alojada en la unidad de control para cargar y administrar patrones de iluminación, cambiar configuraciones y preparar LITOS para un experimento. Se pueden almacenar múltiples patrones de iluminación en la memoria interna de la unidad de control, lo que permite reutilizar los patrones de estimulación sin necesidad de volver a cargarlos. Se puede acceder a la interfaz de configuración de la unidad de control a través de un punto de acceso WLAN creado por LITOS o a través de la red Wi-Fi local. La información necesaria para la conexión, como la dirección IP de LITOS o el nombre del punto de acceso WLAN creado, se muestra en la pantalla interna. Una vez conectado, el usuario puede acceder a la interfaz de configuración desde un navegador web en cualquier computadora o teléfono inteligente independientemente de la plataforma.

Una vez que se transfiere y selecciona un patrón de iluminación, LITOS está listo para realizar el experimento. Los botones LITOS permiten al usuario navegar por el menú, iniciar o cancelar el experimento, o indicar con un contorno en la matriz RGB dónde colocar la placa de pocillos múltiples. El progreso actual de un programa de iluminación en LITOS se puede monitorear directamente en la pantalla de la unidad de control. La película complementaria S1 muestra la matriz LED aplicando un patrón de estimulación en el que cada columna de una placa de 96 pocillos se ilumina secuencialmente.

Mientras realizábamos los experimentos iniciales, descubrimos que la matriz LED generaba calor que posiblemente podría ser perjudicial para la salud de las células. Descubrimos que la matriz de LED se calienta incluso en estado inactivo cuando no se produce estimulación de luz. Para resolver este problema, integramos un circuito que usa transistores de efecto de campo (MOSFET) semiconductores de óxido de metal N y P en la unidad de control de LITOS para entregar corriente eléctrica a la matriz solo cuando se requiere un proceso de iluminación. Esto redujo el desarrollo de calor observado para patrones de estimulación repetitivos. Luego evaluamos el cambio en la temperatura del medio debido a la iluminación LITOS midiendo la temperatura del medio después de diferentes patrones de estimulación. Como era de esperar, nuestras medidas muestran que una estimulación de luz más prolongada y más frecuente condujo a un mayor aumento de la temperatura, que alcanzó una meseta después de aproximadamente 1 h (Figura complementaria S4). Sin embargo, los experimentos que se muestran en este artículo nunca requirieron esquemas de estimulación de luz que produjeran suficiente calor para comprometer la salud celular. En caso de que los experimentos requieran entradas de luz sostenidas durante mucho tiempo, la adición de pequeños disipadores de calor pasivos podría permitir reducir el sobrecalentamiento. Otro enfoque es diseñar el módulo optogenético con un koff bajo para provocar interacciones sostenidas dependientes de la luz. Por ejemplo, en el sistema iLID (dímero inducible por luz mejorado), las afinidades y tiempos de vida de la interacción dependiente de la luz pueden modificarse mediante diversas mutaciones13.

LITOS se presta a un amplio espectro de aplicaciones optogenéticas y sistemas modelo. Para demostrar la flexibilidad y versatilidad de LITOS, realizamos experimentos optogenéticos para estudiar la vía MAPK/ERK. La red MAPK es capaz de decodificar una variedad de señales extracelulares e intracelulares, para convertirlas en decisiones de destino específicas, y desempeña funciones fundamentales tanto en fisiología como en patología14. Por este motivo, se han desarrollado múltiples actuadores optogenéticos y biosensores fluorescentes para controlar y medir diferentes nodos de señalización de esta vía, lo que lo convierte en un sistema modelo ideal para exhibir LITOS.

Utilizamos fibroblastos NIH3T3 de ratón y líneas de células epiteliales mamarias MCF10A, diseñadas para expresar de manera estable un circuito codificado genéticamente que consta de un actuador optogenético para activar diferentes nodos en la red MAPK y un biosensor fluorescente para registrar la dinámica de la salida de señalización ERK. Este circuito consta de un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos optogenético (optoFGFR), que consta de un dominio intracelular miristoilado del receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos fusionado con el dominio sensible a la luz CRY2 que, al ser estimulado con luz azul, se multimeriza, autofosforila y activa la vía MAPK4 . La salida de señalización de ERK luego se puede medir utilizando un reportero de translocación de quinasa ERK (KTR) que informa sobre la actividad de ERK con una resolución de una sola célula15. Para ser espectralmente compatible con la activación optogenética, ERK-KTR se fusiona con una proteína fluorescente roja mRuby2 que se puede excitar sin activar el optoFGFR. Además, ambas líneas celulares expresan de forma estable un marcador nuclear histona H2B fusionado con la proteína fluorescente de rojo lejano miRFP703 (H2B-miRFP703). Un esquema de este circuito genético se muestra en la Fig. 4a. Luego usamos un enfoque de visión por computadora para inferir el estado de activación de ERK para cada celda (Fig. 4b). Para ello, los núcleos se segmentaron automáticamente mediante el canal H2B-miRFP703 y se utilizaron para derivar una máscara nuclear y una máscara de anillo citosólico alrededor del núcleo. Luego, se calcula una proporción de las intensidades de fluorescencia medianas del canal ERK-KTR-mRuby2 usando las máscaras citosólica y nuclear como un indicador de la actividad de ERK (relación C/N)16.

LITOS en el estudio de la dinámica de señalización de la vía MAPK. (a) Tras la estimulación de optoFGFR, la vía MAPK se activa, lo que conduce a la fosforilación y posterior activación de ERK. ERK activo fosforila ERK-KTR, lo que lleva a su translocación reversible al citosol. (b) Tubería de visión artificial para el análisis de imágenes. La segmentación nuclear de las células NIH3T3 (roja), basada en el marcador nuclear H2B, y su expansión en forma de anillo (azul) se utilizan para medir la relación entre el citosol y el núcleo (C/N) de ERK-KTR. Una alta relación C/N corresponde a una alta actividad de ERK. (c) La fila superior representa la relación ERK-KTR C/N codificada por colores de todas las células NIH3T3 en pocillos de 6,38 mm de diámetro (placa de 96 pocillos). Las dos filas inferiores representan un ejemplo de resolución completa de un FOV que compone la imagen más grande de arriba, con H2B-miRFP703 y ERK-KTR-mRuby2 mostrados en escala de grises invertida. ( d ) Las células MCF10A que expresan ERK-KTR se estimularon con un pulso de luz de 10 s de largo, se fijaron con paraformaldehído al 4% y su actividad ERK se cuantificó como se muestra en ( b ). A continuación, se comparó la actividad de ERK con una transferencia Western contra ERK fosforilada y total de las mismas células (abajo). Las transferencias Western nativas, no recortadas, están disponibles en la Fig. S4 complementaria.

La primera característica de LITOS que evaluamos fue la capacidad de la matriz de LED para estimular de manera homogénea todas las células dentro de un pozo. Esta característica es crucial para las aplicaciones de toda la población. Para este propósito, estimulamos placas de 96 pozos, en las que cada pozo está iluminado por cuatro LED, y medimos ERK-KTR C/N en todas las celdas de un pozo al adquirir una gran imagen de mosaico de cada pozo completo. La visualización de los valores de la relación ERK-KTR C/N de cada célula individual en pozos completos reveló que los cuatro LED de un solo pozo indujeron una activación optogenética robusta y homogénea de la vía MAPK (Fig. 4c). Debido a que los diferentes experimentos se realizaron en pozos adyacentes, esto también muestra que la pequeña cantidad de luz que se derrama no conduce a la activación de la actividad ERK.

Luego probamos la capacidad de LITOS para generar una activación ERK sólida con un método bioquímico promedio de población, mediante el uso de análisis de transferencia Western con un anticuerpo fosfoERK (pERK). Para producir suficiente lisado de proteínas, sembramos células MCF10A en placas de 6 pocillos, lo que produjo alrededor de 250 µg de lisado de proteínas por pocillo. La iluminación de un pocillo completo de una placa de 6 pocillos requería encender 112 LED (Fig. 2c, panel inferior derecho). Estimulamos las células que expresan optoFGFR usando un pulso de luz azul de 10 s con LITOS y fijamos las células usando paraformaldehído en diferentes momentos con un intervalo de 3 min. Para comparar la dinámica de activación de ERK observada mediante transferencia Western versus el biosensor ERK-KTR, medimos la relación ERK-KTR C/N en todos los pocillos antes de la extracción de proteínas. Para promediar cualquier variabilidad local de las relaciones C/N de ERK-KTR de una sola célula, muestreamos cada pocillo con 16 FOV y calculamos su promedio de población. La medición de Western blot de pERK endógeno sigue de cerca la medición de la actividad de la quinasa ERK utilizando el biosensor ERK-KTR. De acuerdo con las observaciones previas5,16, las señales de pERK y ERK-KTR mostraron un fuerte aumento en la actividad de ERK directamente después de la estimulación con luz, seguido de una adaptación más lenta, que conduce a niveles de actividad de ERK previos a la estimulación en 20 minutos apropiados. La señal de ERK-KTR (pico a los 6 min) se retrasó ligeramente en comparación con la señal de pERK (pico a los 3 min) (Fig. 4d). Esto podría reflejar el tiempo que necesita ERK para trasladarse al núcleo y/o el tiempo que necesita el biosensor ERK-KTR para trasladarse al citosol.

Estos experimentos muestran que LITOS puede activar de manera uniforme y confiable todas las células en un pocillo grande y demuestra que puede estimular la gran cantidad de células requeridas para el western blot. Esto hace que LITOS también sea compatible con otras mediciones del promedio de la población (p. ej., transcriptómica o (fosfo)proteómica).

Para aprovechar al máximo el potencial de la optogenética en el control de procesos biológicos dinámicos, LITOS debería ser capaz de activar diferentes actuadores optogenéticos, además de tener una gran flexibilidad para crear patrones de iluminación complejos. Por lo tanto, realizamos una serie de experimentos adicionales para demostrar que LITOS cumple con estos requisitos. En todos los experimentos siguientes, programamos LITOS para aplicar automáticamente las entradas de luz a diferentes pozos en momentos específicos, de modo que las células en una placa de 96 pozos se puedan fijar simultáneamente al final del experimento. Después de la fijación celular, tomamos imágenes de todos los pozos de las placas usando microscopía automatizada. Luego aprovechamos nuestra tubería de análisis de imágenes automatizada para calcular una actividad ERK media por pozo. Tenga en cuenta que realizar tales experimentos con pipeteo de factores de crecimiento para activar la red MAPK de manera resuelta en el tiempo sería muy laborioso.

Primero evaluamos si LITOS también es capaz de estimular un actuador optogenético que utiliza un mecanismo de activación diferente al de optoFGFR. A diferencia de optoFGFR, que se basa en la multimerización de un receptor de membrana sensible a la luz, optoRaf17 implica el reclutamiento dependiente de la luz de un dominio c-Raf catalítico en la membrana a través de un sistema CRY2. Para evaluar si LITOS también puede estimular optoRaf, analizamos entradas de luz de diferentes duraciones y las comparamos con la estimulación con optoFGFR. Observamos que un pulso de luz de 30 s indujo una mayor amplitud de ERK en el sistema optoRaf versus optoFGFR (Fig. 5a). Esto también fue evidente en puntos de tiempo posteriores. En respuesta al aumento de la entrada de luz, optoFGFR condujo a una transición de dinámicas ERK transitorias a sostenidas, como se observó anteriormente5, mientras que optoRaf siempre mostró dinámicas ERK adaptativas. Las diferentes dinámicas de ERK inducidas por las entradas optoFGFR y optoRaf podrían reflejar diferentes mecanismos de actuación o una diferencia en la capacidad de los dos actuadores para activar ERK desde diferentes niveles dentro de la red MAPK: optoFGFR desencadena la activación de una red MAPK completa aguas abajo de la receptor, mientras que optoRaf solo desencadena la activación de una red MEK/ERK aislada. Esto ilustra cómo se puede usar LITOS para estudiar la dinámica ERK inducida por diferentes actuadores optogenéticos.

Mostrando la versatilidad de LITOS en el estudio de la dinámica de señalización MAPK. ( a ) Respuesta de ERK a las entradas de luz optoFGFR o optoRaf en diferentes puntos de tiempo. (b) Detección de fármacos pequeños en NIH3T3 que expresa optoFGFR realizada en una única placa de 96 pocillos usando diferentes concentraciones del inhibidor de Raf RAF709, el inhibidor de ERK SCH772984 y el inhibidor de MEK U0126. ( c ) Dinámica de actividad de ERK medida después de un solo pulso de luz azul de 2 s de largo con LITOS medido con una resolución temporal de 1 min. ( d ) Comparación de la dinámica de actividad ERK pulsátil y sostenida generada con LITOS. ( a - d ) La actividad de ERK se midió como ERK-KTR C / N. Los diagramas de caja representan la mediana (línea central), el segundo y tercer cuartil (cajas) y el rango intercuartílico de 1,5 (bigotes) de las mediciones de C/N de ERK-KTR de una sola celda. Los gráficos de líneas representan el promedio (línea) y el error estándar del intervalo medio (barras de error) de las mediciones de ERK-KTR C/N de una sola celda.

Luego, evaluamos más a fondo el potencial de LITOS para realizar una detección de drogas con la dinámica ERK como lectura (Fig. 5b). Como prueba de concepto, probamos 3 fármacos que inhiben la vía MAPK: el inhibidor de Raf RAF709, el inhibidor de MEK U0126 y el inhibidor de ERK SCH772984. Aplicamos cada inhibidor a 2 concentraciones. Estimulamos las células optoFGFR con un solo pulso de luz azul de 10 s en presencia de los inhibidores y medimos la actividad de ERK en 12 puntos de tiempo diferentes con una resolución de tiempo de 2 minutos. Los tres fármacos condujeron a una reducción dependiente de la dosis de la actividad de ERK. El pico de actividad de ERK se redujo notablemente con las dos concentraciones más altas de RAF709 y U0126, o incluso se anuló con la concentración más alta de SCH772984 (Fig. 5b). Esto demuestra que LITOS es adecuado para detectar perturbaciones de la dinámica de señalización con relativamente poco esfuerzo.

A continuación, evaluamos el potencial de LITOS para estudiar la dinámica de ERK que requiere una alta resolución temporal. Para este propósito, estimulamos las células optoFGFR con un solo pulso de luz azul de 2 s y fijamos las células con una resolución de tiempo de 1 min. Esto capturó detalles altamente resueltos de la dinámica de actividad de ERK, como la fase pronunciada de activación de ERK seguida de una fase más lenta de adaptación (Fig. 5c). Este resultado enfatiza la capacidad de LITOS para estudiar eventos de señalización rápida.

Los experimentos que documentamos hasta ahora se basan en pulsos únicos de luz azul. Sin embargo, se sabe que diferentes redes de señalización codifican diferentes patrones de señalización dinámica que pueden consistir en dinámicas de señalización transitorias, sostenidas, oscilatorias o pulsátiles18. La reproducción de estos perfiles dinámicos complejos utilizando un enfoque de biología sintética podría proporcionar información clave sobre la red que da forma a estas dinámicas. Por lo tanto, evaluamos la capacidad de LITOS para producir patrones de entrada de luz más complejos para evocar patrones dinámicos ERK sintéticos específicos. Para ello, programamos LITOS para estimular las células optoFGFR con pulsos de luz de 10 s de frecuencia alta (cada 2 min) o baja (cada 20 min) durante un total de 84 min. Descubrimos que los pulsos de luz de alta frecuencia evocan una dinámica ERK sostenida (Fig. 5d). Esto es consistente con el hallazgo de que un solo pulso de luz azul enciende el optoFGFR durante aproximadamente 5 a 10 min5, lo que no permite que ERK se desactive si el optoFGFR se reactiva cada 2 min. En contraste, los pulsos de luz de baja frecuencia evocaron pulsos ERK discretos y sucesivos que mostraron una adaptación a la línea de base hasta que se aplicó una nueva entrada de luz. Esto muestra cómo se puede usar LITOS para ajustar con precisión la dinámica ERK sintética definida por el usuario. Este experimento requirió aplicar diferentes esquemas de estimulación de luz a 86 pocillos de la placa de pocillos (esquemas de estimulación en las figuras complementarias S6 y S7), lo que ilustra la complejidad de los experimentos que LITOS puede abordar. LITOS proporcionó la resolución de tiempo para capturar una disminución transitoria en la fosforilación de ERK-KTR (Fig. 5b, d) que hemos demostrado anteriormente como resultado de la activación de optoFGFR-calcineurina5. En conjunto, estos resultados muestran que LITOS es un dispositivo optogenético altamente flexible que permite realizar experimentos complejos para estudiar la dinámica de la vía MAPK.

Presentamos LITOS, una herramienta de matriz LED fácil de usar, económica, fácil de montar y robusta con el objetivo de democratizar los experimentos de estimulación optogenética basados ​​en incubadoras. LITOS se compone de piezas que se pueden comprar fácilmente en línea o pedir al fabricante. Aquí y en un repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS), brindamos instrucciones para ensamblar y usar LITOS. También documentamos una solución de software dedicada para controlar LITOS. Comparamos LITOS mediante el estudio de la dinámica de la vía de señalización de MAPK, que puede manipularse mediante diferentes actuadores optogenéticos y medirse con un biosensor fluorescente. Esto demostró que la densidad de LED en LITOS es suficiente para estimular uniformemente todas las células cultivadas en placas de pocillos (Fig. 4c), lo que permite realizar mediciones confiables del promedio de población utilizando métodos bioquímicos como Western blot (Fig. 4d). Además, mostramos que LITOS es compatible con dos actuadores optogenéticos diferentes (Fig. 5a), proporciona el rendimiento necesario para realizar pequeños análisis de drogas (Fig. 5b), permite mediciones de alta resolución temporal (Fig. 5c) y permite la aplicación de esquemas complejos de estimulación de luz (Fig. 5d). Estas características satisfacen las necesidades del campo de la optogenética en rápida expansión y su aplicación en el estudio de procesos dinámicos.

La importancia de la regulación dinámica de los procesos biológicos, incluida la dinámica de señalización, ha sido cada vez más reconocida en los últimos años18. La dinámica pulsátil de la actividad de ERK observada en colectivos epiteliales es uno de los ejemplos más llamativos16,17,19,20,21,22. Aquí, se ha demostrado que la frecuencia de los pulsos de ERK de amplitud y duración constantes controla diferentes decisiones de destino, como la muerte celular, la supervivencia, la proliferación y la migración16,19,21,22. Los biosensores fluorescentes nos han permitido visualizar estos eventos de señalización en escalas espaciales y temporales adecuadas. La optogenética ahora también nos permite controlar estos procesos biológicos en estas escalas de tiempo y espacio biológicamente relevantes de una manera no invasiva. Anteriormente habíamos demostrado que la aplicación de entradas optoFGFR u optoRaf de frecuencia modulada puede evocar regímenes dinámicos de ERK de frecuencia modulada en los que todas las células de la población responden sincrónicamente16. Esto contrasta con la aplicación masiva sostenida de factores de crecimiento comúnmente utilizada que a menudo conduce a comportamientos de señalización heterogéneos y no sincronizados16,19,23. Aquí, LITOS revela nuevamente que esto ocurre cuando se aplican entradas específicas de optoFGFR mediadas por luz. La aplicación de una entrada de optoFGFR mediada por luz con LITOS condujo a una activación de ERK pronunciada homogénea de la población seguida de adaptación, lo que llevó a todas las células de una población a experimentar un pulso de ERK idéntico (Fig. 4c). Múltiples pulsos de luz, aplicados a baja frecuencia, podrían conducir a pulsos ERK discretos sincrónicos de población (Fig. 5d). Por el contrario, cuando esos pulsos de luz se aplicaron a alta frecuencia, eso no permitió la inactivación del optoFGFR5, se pudo evocar una actividad ERK sostenida (Fig. 5d). Prevemos que estas características de LITOS, así como de dispositivos similares, aumentarán la confiabilidad de las mediciones bioquímicas promedio de la población, como western blot, transcriptómica o (fosfo) proteómica. Aquí, la capacidad de inducir la dinámica de ERK sincrónica de la población proporcionará mediciones promedio de población confiables utilizando enfoques bioquímicos. Esto contrasta con los experimentos de estimulación del factor de crecimiento a granel que podrían promediar estados de señalización heterogéneos. Por ejemplo, imaginamos que los fosfoproteomas altamente resueltos temporalmente de un pulso ERK evocado por una entrada transitoria de optoFGFR podrían mapear las fluctuaciones de los fosfositos en escalas de tiempo biológicamente relevantes, proporcionando una mejor comprensión de la señalización del receptor tirosina quinasa-MAPK. Alternativamente, la capacidad de evocar dinámicas de ERK sintéticas deseadas que pueden inducir decisiones de destino específicas (p. ej., supervivencia, proliferación, diferenciación), cuando se combina con enfoques ómicos (p. ej., transcriptómica, (fosfo)proteómica) podría proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo se comportan las dinámicas de ERK. decodificados en decisiones de destino. Al aprovechar el repertorio en constante expansión de biosensores y actuadores optogenéticos, imaginamos que se puede aplicar una lógica experimental similar a otros sistemas de señalización.

Otro potencial importante de LITOS está en el estudio de procesos biológicos que ocurren en escalas de tiempo durante varios días que requerirían microscopios dedicados durante grandes cantidades de tiempo para la estimulación optogenética. Esto se ilustra en un estudio separado en el que usamos LITOS para controlar optogenéticamente la señalización de ERK en la morfogénesis de los acinos mamarios en 3D, un proceso de desarrollo que se desarrolla durante un período de 2 semanas24. Nos enfocamos en un episodio de desarrollo dependiente de ERK en el que la luz acinar se forma a través de la supervivencia de las células externas y la apoptosis de la masa celular interna en un proceso que dura aproximadamente una semana. Descubrimos que la frecuencia del pulso ERK era más alta en las células externas que en las células internas, y planteamos la hipótesis de que, por lo tanto, la frecuencia del pulso ERK dicta la supervivencia frente a los destinos de la apoptosis. Usando actuadores optoFGFR y optoRaf, usamos LITOS para evocar diferentes regímenes de pulso ERK modulados por frecuencia sintética. Observamos que los regímenes de pulso ERK de alta frecuencia rescataron los fenotipos de supervivencia en las células internas, lo que dificulta la formación de la luz del acino. Estos resultados ilustran cómo LITOS puede controlar eventos morfogenéticos que ocurren en varios días en experimentos realizados dentro de una incubadora de cultivo de tejidos. Prevemos que el control de actuadores optogenéticos mediado por LITOS podría usarse para una amplia gama de aplicaciones en biología 3D, incluido el cultivo de organoides.

El diseño simple de LITOS lo hace versátil y asequible. Si bien restringimos nuestro estudio a los sistemas basados ​​en CRY2, la matriz LED RGB de LITOS también debería permitir el control de actuadores optogenéticos basados ​​en dominios cryptochrome, dronpa y LOV (p. ej., iLID, TULIP)25. Sin embargo, la simplicidad de LITOS también puede tener algunas limitaciones. La densidad de potencia máxima se encuentra en el extremo inferior del rango con respecto a otros dispositivos comerciales y de código abierto (Tabla complementaria S1). Recomendamos a los nuevos usuarios que prueben si su sistema optogenético favorito puede ser activado por la intensidad de la luz que produce LITOS. Además, LITOS no es espectralmente compatible con actuadores basados ​​en fitocromos que requieren luz infrarroja. Sin embargo, prevemos que los nuevos actuadores optogenéticos que se pueden activar con longitudes de onda adicionales estarán disponibles en el futuro26 y ampliarán el rango de aplicación de LITOS.

En resumen, desarrollamos y probamos LITOS, un dispositivo de iluminación LED económico, robusto y fácil de usar para optogenética. Hemos ilustrado cómo se podría usar LITOS en el estudio de la señalización de MAPK. Visualizamos una amplia gama de aplicaciones para LITOS fuera del campo de la señalización. Por ejemplo, podría aplicarse para estudiar la expresión génica controlada por la luz en bacterias27, la investigación de biología del desarrollo en Drosophila28 o para la edición del genoma fotoactivable CRISPR-Cas929.

Más información sobre LITOS, cómo pedir uno y su código fuente abierto está disponible en el siguiente repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

LITOS consta de una matriz LED RGB disponible en el mercado (módulo de pantalla LED interior P3, 32 × 64 píxeles, con IC FM6126A, de Shenzhen Xuyang Technology Co. Ltd., aunque también podrían utilizarse módulos con otros circuitos integrados) para la estimulación celular. y una placa de circuito impreso personalizada (PCB). Las emisiones máximas del LED de la matriz RGB son de 620 a 630 nm para el rojo, de 520 a 525 nm para el verde y de 465 a 470 nm para el azul. Para cada LED, se pueden configurar 256 niveles de intensidad con una densidad de potencia máxima para el LED azul de 135 ± 0,11 µW/cm2. El PCB está construido alrededor del módulo ESP32-WROOM (Espressif Systems Shanghai Co. ltd.) y actúa como una unidad de control para la matriz LED. Además de los circuitos necesarios para esta tarea, un módulo de pantalla OLED de 1,5 pulgadas (con IC de control SSD1351) y un zumbador (AI-1223-TWT-3 V-2-R, audio PUI) brinda posibilidades adicionales de salida audiovisual. Los botones de control (B3F-4050, Omron) se utilizan para la entrada del usuario. La programación inicial se puede realizar mediante el puente UART serial USB agregado (231-XS, FTDI). La energía es suministrada por un adaptador de corriente de pared externo de 5 V, conectado a un conector jack de barril de 2,1 mm × 5,5 mm colocado en la PCB. Como hay componentes que requieren un voltaje menor de 3,3 V, se agregó un regulador de voltaje lineal (LM1117, Texas Instruments) a la PCB. El diagrama de circuito de LITOS, los archivos de diseño de PCB (generados con KiCad 6.01, https://www.kicad.org/) y su lista de materiales se pueden encontrar en nuestro repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS) .

El PCB se conecta a la matriz de LED RGB con un cable que proporciona la potencia requerida y con un cable plano de 16 pines que se utiliza para la transmisión de la señal. Ambos cables se conectan a la PCB ya la matriz LED RGB a través de los cabezales existentes. Finalmente, la PCB se conecta a la fuente de alimentación externa de 5 V. Además, la PCB se puede conectar a una computadora a través de un cable USB. Esto es necesario para cargar inicialmente el software LITOS en el microcontrolador ESP32 (si no lo cargó el fabricante de PCB). Después de eso, la conexión a una computadora se establece a través de Wi-Fi.

Para medir el campo de iluminación, expusimos papel fotográfico (Ilford Multigrade RC DeLuxe 44 M perla) a 1 s de luz azul producida por LITOS a diferentes intensidades, como se especifica en la leyenda. Colocamos el papel fotográfico sobre un portaobjetos de vidrio de 0,17 mm a varias distancias de la matriz LED utilizando exposiciones idénticas. Luego de exponer el papel fotográfico con luz azul, lo revelamos por 1 min. Las fotos de los campos de iluminación fueron escaneadas en escala de grises con una resolución de 400 dpi. Los perfiles de intensidad de los campos de iluminación se produjeron con ImageJ 1.53.

El ESP32, ubicado en la PCB, se programa en C/C++ utilizando la capa de abstracción de hardware de Arduino. La interfaz de configuración está programada en Vue, un marco web progresivo para crear la interfaz de configuración como aplicaciones de una sola página (https://vuejs.org/). El código fuente se puede encontrar en nuestro repositorio de GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

La línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón NIH3T3 fue un regalo de T. Hunter, Salk Institute for Biological Studies en La Jolla, California. La línea de células epiteliales mamarias humanas no tumorigénicas MCF10A fue un regalo de JS Brugge, Harvard Medical School, Boston, MA. Mantuvimos las células NIH3T3 en glucosa media-alta (DMEM) modificada de Eagle de Dulbecco de Sigma-Aldrich (Ref: D5671) suplementadas con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, 200 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina y 200 nM l -glutamina. Antes de pasar, la confluencia se mantuvo por debajo del 40-50 % para evitar cambios en el comportamiento de las células NIH3T3. Las células MCF10A se mantuvieron en DMEM:F12 (D8437) de Sigma-Aldrich suplementado con suero de caballo al 5 %, 200 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina, 20 ng/ml de EGF (Peprotech), 10 µg/ml de insulina ( Sigma-Aldrich/Merck) y 0,5 µg/ml de hidrocortisona (Sigma-Aldrich/Merck).

Se privaron de alimento a células NIH3T3 y MCF10A en un medio que consistía en mezcla de nutrientes Ham's F-12 (Sigma N4888) con 200 U/ml de penicilina y 200 µg/ml de estreptomicina y 200 nM de L-glutamina y albúmina sérica bovina al 0,5 % para las células NIH3T3 y DMEM:F12 (Sigma D8437) suplementado con BSA al 0,3%, hidrocortisona 0,5 µg/ml y penicilina 200 U/ml y estreptomicina 200 µg/ml para células MCF10A. Las células NIH3T3 y MCF10A se modificaron de manera estable para expresar optoFGFR (fusionado con una proteína fluorescente mCitrine) u optoRAF (fusionado también con una proteína fluorescente mCitrine). OptoFGFR fue transducido por un vector lentiviral (Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit) y optoRAF por un plásmido PiggyBac (pPB3.0.PURO.CRY2.cRAF.mCitrine.P2A.CIBN.KrasCT). Ambos sistemas expresan resistencia a la puromicina que usamos para seleccionar células transducidas de manera estable. Las líneas celulares que expresan estos actuadores optogenéticos se transfectaron adicionalmente con dos plásmidos PiggyBac adicionales para expresar de forma estable ERK-KTR-mRuby2 con resistencia a la higromicina y el marcador nuclear H2B-miRFP703 con resistencia a la blasticidina. Para las células NIH3T3, los plásmidos PiggyBac se transfectaron usando el reactivo de transfección jetPEI. Para las células MCF10A, los plásmidos se transfectaron con el reactivo de transfección FuGENE HD (Sigma). Después de la transfección, las células se seleccionaron con antibióticos. Además, NIH3T3 se clasificó mediante FACS mientras que las células MCF10A se expandieron clonalmente para aumentar la homogeneidad de la expresión de los biosensores.

Sembramos 2 * 103 células NIH3T3/pocillo en una placa de 96 pocillos para los experimentos de imagen y 1,5 * 106 células MCF10A/pocillo en una placa de 6 pocillos para transferencia Western. En ambos casos, utilizamos placas de múltiples pocillos con fondo de vidrio óptico recubiertas con fibronectina de 10 μg/mL durante una hora antes de la siembra. Las células se privaron de alimento durante 24 h antes del inicio del experimento.

Para todos los experimentos, los patrones de iluminación LITOS se crearon en LibreOffice Calc. Para cargar los archivos csv, conectamos una computadora portátil al punto de acceso de LITOS y usamos la interfaz de usuario. A continuación, la placa de pocillos múltiples se colocó en la matriz de LED en la incubadora. Para garantizar la colocación adecuada de la placa de pocillos, utilizamos una máscara de plexiglás especialmente diseñada con una fresadora CNC (Fig. S3c complementaria). Se permitió que las células se adaptaran durante al menos una hora a las condiciones de la incubadora antes de iniciar un experimento optogenético. Si el protocolo experimental lo permitía, evitamos abrir la incubadora durante el experimento. Después de la estimulación, las células se fijaron añadiendo el mismo volumen de solución de paraformaldehído al 4% al volumen de medio presente en el pocillo. Para todos los experimentos mostrados, los diferentes puntos experimentales se estimularon en puntos de tiempo específicos para luego fijarlos simultáneamente al final del experimento. Después de 10 min de fijación, lavamos las células dos veces con PBS.

Las imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse Ti equipado con 20x Plan Apo Lambda (NA 0.75) y una cámara Andor Zyla 4.2+. Para la excitación, utilizamos las siguientes fuentes de luz LED: 555 nm para ERK-KTR y 640 nm para marcador nuclear). Para la estimulación de optoFGFR usamos una fuente de luz LED de 488 nm. El análisis de imagen se realizó con un pipeline establecido en nuestro laboratorio16. Primero, usamos el software Ilastik (versión 1.3.3) para crear un mapa de probabilidad de los núcleos usando el marcador nuclear H2B como imagen de entrada. Ilastik extrae características de píxeles usando un banco de filtros y las clasifica usando un algoritmo de bosque aleatorio. Luego realizamos la segmentación de instancias en CellProfiler (versión 3.0.0) y segmentamos el citosol en forma de anillo comenzando a 2 px del núcleo y con un ancho máximo de 5 px (Fig. 4b). La distancia de 2 px entre el núcleo y la segmentación del citosol asegura que la imprecisión en la segmentación del núcleo no afecte los resultados. Después de medir la señal de ERK-KTR con esas dos máscaras de segmentación, calculamos la relación entre el ERK-KTR presente en el citosol y en el núcleo (relación C/N). La fluorescencia citoplásmica relativa frente a la nuclear del constructo KTR (proporción C/N) se correlaciona con la actividad de ERK y se puede utilizar como indicador de la actividad de quinasa en células individuales.

Para la transferencia Western, las células primero se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 10 min y luego se lisaron en tampón SDS al 2 % (en TrisHCl, pH 6,8). La concentración de proteínas se determinó con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Ref. 23227, Thermo Scientific). De cada lisado celular, se cargaron 10 µg de proteína en un SDS-Page (gel de fabricación propia al 10%) y luego se transfirieron a una membrana de transferencia Western de PVDF (Ref: 3010040001, Roche). La membrana se incubó con anticuerpo monoclonal de conejo contra ERK total (Ref: #4695) o anticuerpo monoclonal de conejo contra fosfo-ERK (Ref: #4370) ambos de Cell Signaling, y luego con Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked full Ab ( de burro, NA934VS), como anticuerpo secundario. A continuación, la membrana se reveló utilizando reactivos de detección de transferencia Western Amersham ECL Prime (RPN2232) de GE Healthcare.

Los datos de una sola celda se representan con diagramas de caja o media con error estándar de la media, como se describe en la leyenda de la figura relativa. El análisis de datos y las figuras se crearon con R (versión 3.6.3, https://www.r-project.org/)30. Los datos correspondientes y los archivos R-notebook utilizados para el análisis de datos y la creación de imágenes se pueden encontrar en el material complementario.

Todos los conjuntos de datos, incluidos los cuadernos R utilizados para el análisis, se incluyen en la información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias de Suiza Div3 310030_185376 a Olivier Pertz (Schweizerischer Nationalfonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung). Agradecemos al taller técnico del Departamento de Química, Bioquímica y Ciencias Farmacéuticas, el Centro de Imágenes Microscópicas (https://www.mic.unibe.ch) de la Universidad de Berna y Tim Oliver Rod de la Academia de las Artes de Berna. (https://www.hkb.bfh.ch/en/) para soporte técnico.

Estos autores contribuyeron por igual: Thomas Christoph Höhener y Alex Erich Landolt.

Instituto de Biología Celular, Universidad de Berna, 3012, Berna, Suiza

Thomas Christoph Höhener, Alex Erich Landolt, Coralie Dessauges, Lucien Hinderling, Paolo Armando Gagliardi & Olivier Pertz

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas, ETH Zurich, 4058, Basilea, Suiza

Alex Erich Landolt

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TH concibió el diseño de la placa optogenética. AL hizo el desarrollo de hardware y software. CD construyó el circuito genético que consta de optoFGFR, optoRaf y ERK-KTR. PAG produjo las líneas celulares MCF10A con optoFGFR, optoRaf y ERK-KTR. TH realizó y analizó los experimentos basados ​​en células. TH, PAG y LH realizaron las mediciones del campo de iluminación. TH creó todas las figuras. LH creó el estuche impreso en 3D. OP supervisó el trabajo. TH, PAG y OP escribieron el artículo. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Olivier Pertz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Höhener, TC, Landolt, AE, Dessauges, C. et al. LITOS: una herramienta de iluminación LED versátil para la estimulación optogenética. Informe científico 12, 13139 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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Recibido: 01 Marzo 2022

Aceptado: 25 julio 2022

Publicado: 30 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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